呼吸道标本真菌培养阳性结果解读

施毅南京大学医学院附属金陵医院发布于2021-11-04 浏览 5745 收藏

感染性疾病是个永恒的三角，而真菌感染是一个诊治更加困难的永恒的三角。

2019年EORTC/MSGERC新共识延续了2008年分级诊断原则，即确诊、可能诊断及疑似诊断。我国《血液病/恶性肿瘤患者侵袭性真菌病的诊断标准与治疗原则（第六次修订版）》将侵袭性真菌病（IFD）的三级诊断定义为“确诊、临床诊断及拟诊”。但真菌病原学检查仍然是临床诊断和确诊的金标准。

近年来，真菌的微生物诊断方法不断进展。在疑似感染患者中，主要通过临床标本的常规检测（如涂片镜检和培养）、生物标志物检测（如G试验和GM试验）以及分子生物学检查（PCR、mNGS）获得诊断。其中，真菌涂片镜检和培养的敏感性偏低，但仍被业内认为是真菌实验室检查的基石。

感染问题是众多临床医师每天都要面对的问题，当一张临床标本病原微生物培养检验报告单（包括mNGS检测）摆在面前，尤其是真菌检测阳性时，应如何鉴别它的准确性？它的参考价值有多大？是定植还是感染？治疗还是观察？将定植、污染判断为感染，会导致临床过度治疗，增加不良反应发生率，诱导耐药性的产生；而将感染判断为定植、污染，则会延误临床治疗，增加患者的病死率。

鉴别定植、污染与感染的困难较大，尤其是开放系统（包括呼吸系统、泌尿系统、消化道和口腔）标本分离出的病原菌，其中呼吸道标本尤为突出，因为口咽部和鼻咽部为正常菌群的定植部位，痰培养出现病原菌，不能确诊是否为感染，即使采用肺泡灌洗，仍然不能解决这一问题。特别是呼吸道标本中真菌培养阳性的鉴别更为困难，例如呼吸道分泌物包括BALF检测到念珠菌的意义就不大。

2009年IDSA念珠菌病治疗指南指出“呼吸道分泌物念珠菌阳性很少代表感染，不应进行抗真菌治疗”。而2016年IDSA念珠菌病治疗指南指出“呼吸道分泌物念珠菌阳性，通常表示定植，很少需要抗真菌治疗”。相较于2009年指南，2016年指南对分泌物念珠菌阳性的干预推荐不再像以前一样绝对和保守。

临床医生的基本功：正确采集和运送标本

优秀的临床医生应该知道何为最佳标本

组织和无菌体液（血、骨髓、脑脊液、关节液、胸/腹腔穿刺液）标本有很高的诊断价值。
呼吸道标本：BALF＞抽吸分泌物＞诱导痰＞深部痰。
痰临床意义有限，却是临床送检率最高的标本，因此痰标本的可靠性关键在临床，医生必须知道正确留取痰标本的方法。
血培养国内目前的现状是有适应证也不做（意识很差），即使做了，也可能存在检测的套数不足、容量不够、保存与运送不当、实验室没有及时上机等问题。

怎样才算是一份合格的痰标本？

（1）痰标本的采集方法：

医生或护士直视下采集标本，如有必要，可用吸痰器采集。
患者先用无菌生理盐水漱口，去除表面的菌群。
教育患者深咳，收集从下呼吸道咳出的痰液。

（2）时间要求

清晨的痰含菌量最多，是最佳采集时间，但不应受此限制而导致在应用抗生素之后采集所谓“最佳”的痰标本。
应在抗生素使用前采集痰标本。
标本采集后1~2 h内必须立即进行实验室处理。
如果无痰，可用5 ml 3%~5%的NaCl雾吸约5 min导痰，也可采用物理疗法、体位引流、鼻导管抽吸等方法取痰。
不建议24 h之内多次采集，除非痰液外观性状出现改变。

一份合格的痰标本应该是痰涂片镜检每低倍视野＜10个鳞状上皮细胞，＞25个多核白细胞。

不同病原体标本的最佳类型

针对不同病原体，呼吸道标本的类型不同。痰和BALF是所有病原体的最佳标本，但对于病毒，咽拭子亦可。

2017年欧洲指南对于真菌感染气道标本检测的实验室推荐如下。

不同感染获取的标本不同。如果是上呼吸道，真菌多为念珠菌，所以最佳标本为口腔黏膜拭子、舌拭子或口咽拭子。

下呼吸道标本中，痰和支气管镜标本最为重要。

医院获得性肺炎，如果培养曲霉，最好的标本是支气管抽吸物、BALF和防污染样本毛刷（PSB）。

BALF标本培养的阳性率高，合格率高；采集不需要患者的配合；能避免上呼吸道定植菌的污染，减少对培养结果判断的干扰。对于危重患者，下呼吸道标本获取途径主要包括灌洗和刷检，但作为感染疾病的标本操作应规范，可以参考中华医学会呼吸病学分会感染学组专门制定的感染疾病支气管肺泡灌洗操作规范。

检验医生的基本功：正确地检测标本

痰标本在病原学诊断中面临的困难

咳痰：CAP患者40%以上无法或及时产生痰。
痰标本：合格率较低，甚至送检唾液。
培养：痰培养阳性率受多种因素影响且影响极大，包括标本采集、运输、快速处理、合理应用细胞学判断标准、前期有无抗菌药物治疗、解释技能。
涂片革兰染色：最新数据表明，通过革兰染色辨别1669个CAP住院患者合格标本，仅有14%可以辨别出主要形态类型。

涂片结果的规范报告应包括的内容

（1）必备要素：①检测项目；②微生物学检查：阴性、阳性，具体描述，细菌革兰染色（形态、染色、排列、半定量、比例）；③细胞学检查结果。

（2）建议要素和注意事项。

另外，真菌病原体的名称应规范，如“卡氏肺孢子虫”应为“耶氏肺孢子菌”、“马尔尼菲青霉”应为“马尔尼菲篮状菌”、“肠杆菌科细菌”应为“肠杆菌目细菌”、“恙虫病立克次体”应为“恙虫病东方体”、“曲霉菌、毛霉菌”应为“曲霉、毛霉”、“接合菌”（取消），应为“毛霉”，等。

不合格标本：实验室应拒收

实验室应有客观标准判断质量。
临床要理解、支持实验室拒收标本。
只有标本合格，结果才有意义。

痰标本—从检验的角度如何区分定植与感染

最简单和最直接的证据就是痰涂片：①感染菌会导致白细胞大量增加；②感染早期（细菌，真菌）启动非特异性免疫因子；③中性粒细胞是最主要的免疫细胞，吞噬和包裹现象是反映病原菌与机体免疫系统相关性的最重要信号，观察这一现象有助于区分定植和感染。

BALF的涂片革兰染色

适量BALF标本进行细胞离心，经自然干燥、甲醇固定或火焰快速固定3次，革兰染色。
标本质量判断以扁平鳞状上皮细胞占全部细胞比例＜1%为合格标本。
敏感度为10⁴个细胞/ml，若每个油镜视野可见1个或多个细菌，报告革兰染色形态及白细胞结果，提示此菌与活动性肺炎相关。

直接镜检是诊断念珠菌、霉菌定植最简单和实用的方法

标本的直接显微镜检查：取脓液、痰和局部炎症性分泌物直接涂片，革兰染色后，直接镜检，显微镜下见到革兰阳性（着色不均匀）、圆形或卵圆形菌体或孢子及假菌丝。

培养结果的报告规范

（1）普通培养：①无菌部位标本培养阴性：多少天？②无菌部位标本培养阳性：多少天？③正常有菌部位标本培养，完全无菌生长；④正常有菌部位标本培养，仅有正常菌群分离；⑤正常有菌部位标本培养，2种或2种可能致病菌，伴或不伴正常菌群分离。

（2）靶向培养，重复分离株，拒收报告，注意事项。

痰标本镜检与培养结果阳性的可能

（1）标本不合格（即污）：痰标本采集本身就存在诸多可能被污染的情况，痰标本在运送或保存或接种等过程中易受到污染。临床上这种情况往往容易被忽视，且不易避免。

（2）定植：念珠菌广泛定植于口咽部和鼻咽部，无论是痰液还是支气管分泌物检测阳性，都为定植菌。镜检直接观察念珠菌有无假菌丝或菌丝可以为定植还是感染提供一些线索。

（3）感染：临床真菌感染已经较为常见，一些临床医师认为痰培养念珠菌阳性一定是定植菌的观念是不全面的。标本合格，涂片有菌丝，培养阳性，两者一致，多部位多次送检，结合临床判定。

结果阳性的判定在无菌部位和带菌部位意义不同

（1）直接镜检法：在无菌体液的直接镜检中发现真菌成分常可确立深部真菌病的诊断，但在有菌部位只有发现大量真菌才具有诊断意义。

（2）培养检查法：一般来说，一旦培养出肯定的致病菌，如新生隐球菌或组织胞浆菌时，可确立感染的存在；但如果分离出条件致病菌如白念珠菌、烟曲霉时，则应结合临床进行判断；从无菌部位如血液或脑脊液中分离出条件致病菌常提示肯定的感染，但对于来自脓、痰或尿的标本，则应谨慎解释结果，仅靠一次培养阳性往往不能确定诊断。

BALF培养的意义

（1）细菌性感染：浓度阈值10⁴ cfu/ml，低于阈值浓度时，定植可能性大；高于阈值时，感染可能性大。

（2）真菌性感染：目前没有BALF的诊断性阈值。

（3）丝状真菌也没有阈值，但丝状真菌在呼吸道分泌中的价值远大于酵母菌属。

临床与实验室沟通：结合临床进行鉴别

定植与感染的区分方法

（1）结合患者罹患真菌感染的危险因素。

宿主：危险因素的更新——不同真菌的危险因素不同。

ICU患者的侵袭性肺曲霉病定义更新：更多危险因素被纳入。

肺移植患者的IFI危险因素。

慢性阻塞性呼吸道病变患者入住ICU和曲霉定植伴随高IPA风险。

支气管扩张患者高曲霉气道定植率、慢性感染和过敏常见。

肺念珠菌感染与多方面因素相关，而非单纯的免疫因素。其中，疾病因素包括慢阻肺、肺炎、肺癌、哮喘、支气管扩张、慢性支气管炎、气胸、胸膜疾病、急性支气管炎、上呼吸道感染、肺间质疾病、肺结核、OSAS、肺脓肿和其他。患者因素包括老年、胃肠道功能差、肝肾功能差等。治疗药物及手段因素包括类固醇糖皮质激素的应用、机械通气、留置导尿管、中心静脉插管、全肠外营养等。上述因素均可导致念珠菌感染性侵袭。

（2）结合患者的临床：表现，影像，实验室。

微生物检查阳性不等同于感染。

病原体分离部位：正常无菌的体腔（血液、脑脊液、胸腔和腹腔积液等）中分离到的病原体，考虑责任病原体。
非无菌部位（皮肤、黏膜或创面）分离的病原体，同时结合有无临床、影像、生化以及组织病理依据，多倾向于定植。
但如果脓液培养，或反复为同一结果，或保护性标本，或菌落计数达到一定量，倾向于感染。

支气管镜在侵袭性肺曲霉病诊断中扮演什么角色？

推荐：我们推荐对疑似侵袭性肺曲霉病患者给予经由气管镜的支气管肺泡灌洗（强推荐，中等证据等级）。支气管肺泡灌洗对于外周结节病灶的穿透率较低。因此，对于此类病灶应考虑给予经皮或经支气管肺活检。我们推荐标准化的BALF采集过程，并对BALF标本性非培养方法检测的同时进行常规的培养和细胞学检测（强推荐，中等证据等级）。

ICU患者侵袭性肺曲霉病的诊断标准：2019年EORTC/MSGERC更新了侵袭性肺曲霉病确诊和临床诊断标准，2021年对应ICU患者特点，EORTC/MSGERC ICU工作组做了相应的调整建议。

（3）结合患者罹患真菌感染的临床评分。

念珠菌定植指数（CI）：每周2次同时送以下6个部位的标本进行培养，计算CI和校正值（CCI），①气道分泌物或咽拭子；②胃液；③尿液；④大便或肛门拭子；⑤伤口拭子或腹部引流液：⑥导管插入部位的拭子。CI=检出菌落部位数/采集标本部位（血液除外）总数。CCI=CI×（菌落重度生长部位数/检出菌落生长部位数）。若CI≥0.5或CCI≥0.4，认为有侵袭性念珠菌感染高风险。
念珠菌评分（CS）辅助判断念珠菌定植和感染：念珠菌多部位定植记1分，外科手术记1分，严重感染记2分，全胃肠外营养记1分。念珠菌定植患者可用念珠菌评分进行评价，以指导治疗，0～5分，定植指数评分越高，侵袭性念珠菌感染可能性越大。

（4）结合患者抗真菌治疗的反应。

患者存在的危险因素越多，越应尽早启动针对念珠菌的经验性治疗。如危险因素少，真菌检查提示阴性，可以不采取治疗措施。

小结

临床医生应重视临床资料的收集，正确地采集标本、保管和运送，并及时送检。
微生物实验室医生应及时接收标本，判断是否为合格标本，及时、规范检测。
临床与实验室加强沟通，互通有无，正确解释结果。
综合评估，结合临床，及时、准确地指导临床治疗

本文由重症肺言整理，感谢施毅教授审阅修改！

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