铜绿假单胞菌下呼吸道感染诊断的进展和困境

一、铜绿假单胞菌下呼吸道感染概述

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是一种下呼吸道感染常见的革兰氏阴性杆菌。PA可形成生物被膜，具有易定植的特征，结构性肺病如支气管扩张、慢性阻塞性肺疾病、肺囊性纤维化患者是PA定植或感染的高危人群。在我国，医院获得性肺炎（hospital acquired pneumonia, HAP）病原谱中PA占比16.9%～22.0%，居第2位^[1]。PA也是重症病房感染最常见的病原菌，特别是呼吸机相关性肺炎（ventilator associated pneumonia，VAP）中PA感染率高，感染相关的危险因素包括年龄、疾病的严重程度和合并疾病等^[2]。PA导致的社区获得性肺炎（community acquired pneumonia，CAP）较少见，中国为1.0%左右，但PA可导致重症CAP，死亡率高达61%^[3]。

急性PA下呼吸道感染的危险因素包括：既往有下呼吸道PA分离史、结构性肺病、免疫抑制宿主、90天内全身抗菌药物使用史、接受有创检查或治疗、在PA流行区获得的感染。PA下呼吸道感染的临床表现、肺部影像学表现、实验室检查无特异性，PA下呼吸道感染的确诊依赖于病原学检测结果。

PA急性下呼吸道感染诊断标准为：有急性感染高危因素，符合肺炎、气管支气管炎、肺脓肿、脓胸的诊断，同期合格的下呼吸道标本分离到PA。慢性PA下呼吸道感染的危险因素主要包括：结构性肺病、长期接受免疫抑制剂或糖皮质激素治疗、反复接受全身广谱抗菌药物治疗。高危人群1年内从合格的下呼吸道标本中分离出PA≥2次（至少间隔3个月），并有感染相应的临床表现，影像学出现持续性、新发或加重的肺部渗出、浸润、实变即可诊断PA下呼吸道慢性感染。

二、铜绿假单胞菌下呼吸道感染的病原学诊断进展

痰、支气管抽吸物（endotracheal aspiration，ETA）、支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF)、防污染毛刷( protected specimen brush，PSB）、胸腔积液、血液、肺组织等是常见的下呼吸道感染病原学诊断标本。痰标本易获取、成本低，但合格率仅为33.9%^[4]；采集不规范、标本量不足、储存运输不当是导致假阳性和假阴性率较高的重要因素。痰标本易受上呼吸道菌群污染，ETA、BALF、PSB等由于采样时可直接到达下呼吸道感染部位，敏感性和特异性相对较高，有益于早期诊断。胸腔积液和血培养在PA下呼吸道感染患者中特异性较高，危重症患者应在抗菌药物使用前尽快完成胸腔积液和/或血培养标本采集。肺组织标本获取相对复杂和困难，不是病原学诊断的首选标本；对不能排除感染的患者，在获取肺组织标本时不应仅进行病理学诊断，利用肺组织进行病原微生物诊断易被忽视但至关重要。

利用合格呼吸道标本进行涂片和培养是最常用的铜绿假单胞菌的检测方法，抗原或抗体检测、核酸检测等方法也不断得到发展并用于临床。抗原检测是用PA抗体检测体内有无PA抗原，主要有乳胶凝集试验、直接荧光抗体试验等，特异性高，但检测结果易受抗菌药物使用的影响。抗PA抗体在感染初期阳性率低，诊断抗体的检测无法实现PA感染的病原学快速检测。PA是唯一产生绿脓素（pyocyanin，PYO）的细菌，PYO有氧化还原活性，通过电化学方法可检测到纳米量级的PYO，样品无需预处理、操作简单，灵敏度高，可大规模应用于临床^[5]。电子鼻技术可检测PA代谢产生的挥发性有机物质（volatile organic compounds，VOC），操作简单，但灵敏度和稳定性还需提升^[6]。核酸扩增技术（nucleic acid amplification technique，NAAT）的发展则显著提高了下呼吸道感染病原体检测的灵敏度。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术可直接对菌种进行鉴定，特异性高，灵敏度强，耗时短。多重实时荧光定量PCR（multiple reverse transcription-polymerase chain reaction，MRT-PCR）可实现单一体系中多种病原体的检测，但由于不同引物扩增效率不同，可能出现假阴性。基因芯片技术则是将寡核苷酸片段固定在特定的材料上，检测样品中的靶序列，操作便捷，已实现商品化^[7]。NAAT的共同缺点是不能区分活菌与死菌，扩增过程可能出现碱基错配而影响最终结果。

基于高通量测序技术的宏基因组二代测序（metagenomic next generation sequencing，mNGS）为感染性疾病的诊断带来了突破性进展，mNGS理论上可检测样本中的全部微生物，还可获取耐药突变、进化水平等关键信息，对危重患者、免疫抑制患者或初始治疗失败的患者有重要的诊断和鉴别价值^[8]。但mNGS易受环境微生物、工程菌、检测平台质控水平等因素的影响，需专业的生物信息学人员进行分析，测序成本较高，广泛的临床应用有一定限制。

总而言之，采集合适的临床标本，选择合适的诊断方式，必要时进行多种检测手段联合诊断，可以更加快速地完成PA的病原学诊断。

三、铜绿假单胞菌下呼吸道感染的药敏诊断进展

四、展望和挑战

无论是传统微生物学实验、商业化检测平台还是新兴的分子生物学诊断方法几乎都可以独立完成PA的病原学诊断和耐药检测，但如何使检测更加高效、便捷、经济，仍是未来研究的难点。此外，现有的药敏试验大都是体外试验，是否可以直接通过检测患者标本（如血液、诱导痰、尿液、呼出气等）中PA感染相关的特异性生物标志物来评估急性感染者抗菌药物的有效性，预测慢性感染者的加重风险，也可能是未来研究的方向。与此同时，加快mNGS技术平台建设和基因组序列数据库的扩展，可协助构建PA毒力因子、生物被膜、耐药基因相互作用的复杂调控网络，也能提高临床医师对PA下呼吸道感染的认识，帮助预测PA的流行和传播，加快抗菌药物和疫苗研发，为个体化治疗提供新思路。

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