测序新技术ptNGS在急性呼吸衰竭患者中的应用

作者：冯耘

单位：上海交通大学医学院附属瑞金医院呼吸与危重症医学科

一、病原学检测现状

目前临床上对于病原培养存在很多局限性，主要包括：①大量重要病原体无法通过培养法进行检测；②检测阳性率极低，尤其是脑脊液、血液等样品，病原培养平均阳性率仅在10%左右水平；③检测耗时长，某些重要病原体需要3～4周才能获得培养结果。

对于重症肺炎，25%的临床病原诊断失败；对于脓毒血症，>30%的临床病原诊断失败；而对于脑炎脑膜炎，＞40%的临床病原诊断失败。因此，临床感染患者诊疗迫切需要新的病原学诊断工具。

已有的病原检测方法均难作为住院感染患者的理想病原检测手段。作为住院感染患者诊疗的基础，理想的诊断方法既要覆盖尽可能广泛的病原体种类，又要尽可能廉价，方能被临床广泛接受和应用。对于住院患者，病原筛查的理想方法应具备检测范围广、性能强、速度快、成本低的特点。尽管传统病原检测方法的检测成本低，但病原检测种类太少。而经典宏基因组检测方法（mNGS法）病原检测范围广，但检测成本过高。

2022年，瞿介明教授发表了一项前瞻性多中心研究，该研究综合利用多种检测手段进行中国成人重症社区获得性肺炎病原体调查，结果发现，在不同季节，病原体分布存在差异^[1]。

笔者团队开展的一项研究纳入了本院监护室130例急性呼吸衰竭患者184份mNGS标本，与传统检测技术相比，使用mNGS检测混合感染的比例增多，结核、NTM、PJP、真菌感染检出率较传统检测比例高，可以检测出少见病原体，此外，根据mNGS修改治疗方案占58.5%^[2]。

二、病原体靶向测序

（1）病原培养：难以检测病毒及大量苛养菌，阳性率极低，检测时间长，价格实惠（传统技术<300元）。

（2）荧光定量PCR：同时检测1～13种病原体，灵敏度高，速度极快，价格较低（门诊筛查500～1300元）。

（3）ptNGS：可检测数百种病原体，灵敏度高，速度较快，价格合适（住院筛查1000～2000元）。

（4）mNGS：能检出上万种微生物，灵敏度高，速度较快，价格昂贵（疑难诊断3000～7000元）。

3. ptNGS与mNGS对比的优势所在

4. ptNGS与mNGS的应用场景

笔者团队曾收治一例52岁男性患者，因“反复胸闷气短1个月，加重10天”就诊，患者来院时高流量吸氧（氧浓度90%），氧合指数100～200 mmHg，胸部CT可见双肺实变，大片渗出影，外院抗感染治疗效果欠佳。对于此类患者，需要鉴别感染与非感染疾病。BALF NGS回报均为阴性，两次支气管镜检查及多次肺泡灌洗液均找到腺癌细胞。血基因检测提示19外显子缺失，靶向治疗效果较好。因此，mNGS在排除感染性疾病方面是一种非常重要的检测手段。

5. ptNGS检测种类

上海市肺科医院发表了一项ptNGS技术在结核和非结核分枝杆菌中的应用研究^[3]。笔者团队的研究结果也显示ptNGS和mNGS结果有较好的一致性^[2]。

三、病例分析

送检患者BALF标本行mNGS和ptNGS检测，mNGS回报金黄色葡萄球菌（序列数1759），铜绿假单胞菌（序列数979）。ptNGS也查到了铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌，另外还检出鲍曼不动杆菌、粪肠球菌及巨细胞病毒。

病例2

患者，女性，74岁，主诉“胸闷、气促3月，加重伴发热5天”。类风湿关节炎病史10余年，近3月余因多处关节反复疼痛，持续口服甲泼尼龙片。睡眠障碍伴抑郁症病史约10年，冠心病病史近10年。先后2次行PCI术，置入2枚冠脉支架。3个月前曾出现血糖升高。查体：体温37.2℃，BP 143/64 mmHg，R 18～24次/min，SpO₂ 74%（不吸氧状态）。双肺弥漫性渗出改变，考虑PJP、CMV感染可能性大。

外周血mNGS回报耶氏肺孢子菌（序列数32）、CMV（序列数2499）。ptNGS同样检出耶氏肺孢子菌和CMV。

患者，女性，88岁；主诉“咳嗽、咳痰1月，加重伴发热、气促1周余”。

患者1个月前无明确诱因出现咳嗽、咳痰，为白色脓痰，当时无发热、气促，遂至当地医院住院治疗，予抗感染、化痰、营养支持等治疗后好转，2021年5月4日进食后呕吐，约2小时后出现发热，体温最高达38.5℃，指氧饱和度下降，予吸痰、抗感染、祛痰、解痉、平喘等治疗后未再发热，痰培养提示正常菌群，床旁胸部X线片提示左肺不张，为进一步诊治，于5月9日就诊于我院急诊，5月11日患者19时左右指氧饱和度降至77%，伴意识障碍，调整BiPAP参数未见明显好转，予急插管接呼吸机辅助通气，予镇静、血管活性药物维持血压、留置导尿管、抗感染、补液等，为进一步诊治，急诊以“重症肺炎、呼吸衰竭”为诊断转入我科RICU。

既往有高血压病史，平素服用倍他乐克半片，1次/日；腔隙性脑梗死病史；帕金森综合征病史，目前服用多巴丝肼片1片，2次/日；吡贝地尔50 mg，1次/日。胸部CT可见两下肺实变影，考虑误吸可能性大。

BALF mNGS检测到鲍曼不动杆菌（序列数80519）、铜绿假单胞菌（序列数1139）、金黄色葡萄球菌（序列数281），ptNGS同样也查到了这三种细菌。

四、小结

ptNGS的性价比高。对于常见细菌、病毒及真菌感染，ptNGS的检测灵敏性较好，不受人类基因组及背景菌影响。适用于感染及危重患者的初始病原筛查及明确病原体感染后的治疗复查，且其与mNGS检测结果的一致性较好。

[1] Qu J, Zhang J, Chen Y, et al. Aetiology of severe community acquired pneumonia in adults identified by combined detection methods: a multi-centre prospective study in China[J]. Emerg Microbes Infect, 2022,11(1):556-566.

[2] Huang C, Chen H, Ding Y, et al. A Microbial World: Could Metagenomic Next-Generation Sequencing Be Involved in Acute Respiratory Failure?[J]. Front Cell Infect Microbiol, 2021, 11:738074.

[3] Li B, Xu L, Guo Q, et al. GenSeizer: a Multiplex PCR-Based Targeted Gene Sequencing Platform for Rapid and Accurate Identification of Major Mycobacterium Species[J]. J Clin Microbiol, 2021, 59(2):e00584-20.