真菌感染的实验室诊断

夏欢吉林大学第一医院发布于2024-05-29 浏览 647 收藏

作者：夏欢

单位：吉林大学第一医院呼吸与危重症医学科

在细菌感染中，病原、宿主及药物三者共同影响感染结局，而真菌感染是一个更加复杂的过程，我们除了要考虑真菌的毒力、耐药性和适应性，还要考虑宿主因素（遗传、免疫反应、微生物组学）和环境因素（暴露、健康护理、气候）。2019年欧洲癌症研究治疗组织（EORTC）/美国真菌病研究组（MSG）发布的侵袭性真菌病（IFD）第三版指南将IFD的诊断分为三种：①拟诊（possible）：符合宿主因素和临床标准各1项，但不符合微生物学标准；②临床诊断（probable）：患者需要符合宿主因素、临床标准和微生物学标准各1项；③确诊（proven）：无菌部位标本的镜检或培养等提示真菌感染。

表1 常见致病性下呼吸道真菌种类

我们在查找病原学时，临床标本可有多种选择，包括血、痰、肺泡灌洗液（BALF）、组织、气道吸引物、病灶内脓液、尿等。真菌感染的实验室检测方法主要包括三大类，分别是常规实验室检查，分子标志物检测，分子生物学检查。本文将就这几种方法进行简要综述。

一

常规实验室检查

常规实验室检查是指涂片镜检、培养以及快速现场评价（ROSE）。涂片镜检操作简便，出结果报告最快，但其阳性率并不高，所以可能需要我们反复多次送检，才可能提高检出率。荧光染色可提高真菌镜检的敏感性，而一些特殊染色如六胺银染色及墨汁染色对于肺孢子菌及隐球菌的检出意义重大。培养的优点是如果培养出病原体会做药敏试验，药敏试验结果能够指导下一步的临床治疗，但真菌培养时间很长，一般为7天，甚至更长，且其阳性率也不高。如果鉴定出菌种，需综合临床表现及其他辅助检查等进一步判断是污染菌、定植菌还是致病菌。ROSE技术近年来在很多医院已经开展，可以对部分微生物病原的形态及细胞学背景进行快速判读，尤其对于真菌感染能够作出现场快速诊断。尽管真菌镜检和培养的阳性率不高或等待时间长，但这两种方法仍然是实验室检查的基石。

二

分子标志物检测

1. 抗原检测

抗原检测包括G实验、GM实验、隐球菌荚膜多糖抗原（CrAg）检测、念珠菌甘露聚糖抗原检测，曲霉尿抗原检测。

1.1 G实验

是以真菌细胞壁特有的(1,3)-β-D葡聚糖为标志物的检测方法，是泛真菌检测生物标志物，不能区分真菌种类。G实验在念珠菌、曲霉、镰刀菌、毛孢子菌、枝顶孢霉、暗色真菌、肺孢子菌等感染时都可升高，但不能检测隐球菌和毛霉。目前，国内外指南推荐G实验在诊断侵袭性念珠菌病时采用单一阈值：>80 pg/ml，且推荐连续两次检测。但目前认为G实验阴性对于排除IFD的意义更大。

近年来的真菌相关指南对G实验也有相应的推荐，强调了连续两次或动态监测G实验对诊断的重要性（表2）。此外，导致近年指南对血清G实验的推荐意见

G实验也有很多的干扰因素，下列情况会导致G实验假阳性的发生：①纤维素膜（含葡聚糖成分）进行血液透析；②血液制品（白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白等）；③抗菌药物（磺胺类药物、阿莫西林/克拉维酸、多黏菌素、厄他培南、头孢唑啉、头孢噻肟、头孢吡肟）；④革兰阴性菌菌血症；⑤黏膜炎或胃肠黏膜受损；⑥手术时应用的纱布或海绵(含葡聚糖成分)；⑦抗癌药物（含葡聚糖如香菇多糖）。导致出现假阴性的情况主要有：①隐球菌和毛霉感染；②抗真菌药使用。

综上，G实验在IFD诊断中具有重要意义，是一种早期检测方法，但不能检测隐球菌和毛霉。对于念珠菌血症，G实验为首选方法，且该方法对诊断PJP有很高的价值。但阴性结果排除真菌感染的意义更大。此外，G实验结果对于判断是否停止经验性抗真菌治疗有重要参考价值。

1.2 GM实验

GM实验即半乳甘露聚糖实验，而半乳甘露聚糖是存在于曲霉细胞壁上的特异性多糖抗原，是早期感染的指标。GM实验是严重免疫抑制/粒细胞缺乏患者诊断侵袭性曲霉病（IA）的有效工具。

在2020年《血液病/恶性肿瘤患者侵袭性真菌病的诊断标准与治疗原则》（第六次修订版）推荐：血浆、血清、BALF或脑脊液GM实验可作为曲霉诊断的微生物标准。2019年EORTC/MSG侵袭性真菌病指南推荐血清、BALF、血浆和脑脊液GM实验用于诊断IA。2016年IDSA曲霉病诊断与治疗指南对血液系统恶性肿瘤及HSCT等患者，推荐血清及BALF GM实验作为诊断IA的精确标志物。

GM实验的折点发生了一些变迁。2019年，EORTC/MSG第三版IFD指南推荐检测血清、BALF、血浆和脑脊液中GM实验诊断IA：①单份血清或血浆阈值>1.0；②单份BALF>1.0；③单份脑脊液>1.0；④同时检测血清和BALF时，血清阈值>0.7，BALF阈值>0.8。连续2次以上GM阳性的诊断意义更大。

同样，GM实验也有非常多的干扰因素。导致出现假阳性的因素有以下四大类：①抗菌药物：阿莫西林/克拉维酸、头孢吡肟、头孢哌酮/舒巴坦、头孢曲松、碳青霉烯类、亚胺培南/西司他丁；②其他IFD（青霉、镰孢霉、组织胞浆菌、皮炎芽生菌等）；③新生儿双歧杆菌定植；④多发性骨髓瘤。非粒缺患者和慢性肉芽肿患者的GM实验很可能会出现假阴性。

综上，GM实验适用于怀疑侵袭性曲霉感染的患者，尤其在粒缺患者中；对于非粒缺患者，血清GM实验的敏感性明显下降，阴性结果并不能除外感染。对于非粒缺或预防性应用抗曲霉治疗患者，推荐使用BALF GM实验联合检测。同时，GM实验动态监测可以反映治疗的效果，但要注意GM实验的影响因素。

1.3 隐球菌荚膜多糖抗原（CrAg）检测

隐球菌抗原检测是通过检测隐球菌的荚膜多糖类抗原来诊断隐球菌感染。目前指南推荐脑脊液或血清CrAg检测阳性可以作为隐球菌感染的确诊依据。无论滴度大小，CrAg检测均作为阳性诊断指标，但滴度变化及转阴不能作为疗效监测和判断停药的指标，是否停药以微生物学检查和临床改善情况为准。

1.4 念珠菌甘露聚糖抗原检测

2016年IDSA更新的念珠菌病管理临床实践指南指出，念珠菌甘露聚糖抗原检测的敏感性和特异性分别为58%和93%，念珠菌甘露聚糖抗体检测的敏感性和特异性分别为59%和83%，抗原与抗体联合检测的敏感性和特异性分别为83%和86%。2012年，欧洲临床微生物和感染病学会（ESCMID）关于念珠菌病的诊断及治疗指南推荐血清甘露聚糖/抗甘露聚糖抗体作为早期诊断侵袭性念珠菌病的手段。

1.5 曲霉尿抗原检测

曲霉尿抗原检测目前有一些临床研究，但相关数据并未达到预期，仍缺乏大量循证医学证据，因此临床上尚未开展。

2. 抗体检测

抗体检测主要用于无明显免疫抑制的曲霉感染患者，主要包括曲霉IgE和IgG抗体。曲霉特异的IgE抗体是诊断变应性支气管肺曲霉病（ABPA）的必须条件。曲霉特异性lgG抗体是诊断慢性肺曲霉病（CPA）最敏感的微生物学方法，敏感度和特异度均较高，可区分定植和感染。

白色念珠菌生殖管抗体检测（CAGTA）用于假菌丝形成过程的诊断。CAGTA本质上是念珠菌抗体检测试剂，其机制与葡聚糖抗体检测相似，不同的是，CAGTA检测的是念珠菌菌丝相细胞壁中包含的抗原成分，因此被认为能够较好地鉴别定植和感染。但研究结果并未体现出预期的高特异性，敏感性和特异性仅为66%和76%。念珠菌聚糖抗体IgG和IgM存在阈值的困境，感染患者和定植患者滴度存在重叠，阈值如何判定，仍需更多研究证实。

三

分子生物学

1. PCR

PCR技术尤其是荧光定量PCR检测灵敏度高，对于曲霉、肺孢子菌及念珠菌检测应用前景良好。2020年欧洲指南推荐，无论是曲霉还是念珠菌，如果组织核酸PCR结果阳性，均可作为确诊证据。曲霉PCR检测符合以下任意一项【①血浆、血清或全血连续2次或以上PCR检测阳性；②BALF重复2次或以上PCR检测阳性；③血浆、血清或全血至少1次PCR检测阳性，同时BALF至少1次PCR检测阳性】，都可以作为临床诊断证据。2019年ATS指南中有关PCR在IA诊断中的建议为：对于严重免疫功能低下，例如血液恶性肿瘤、接受造血干细胞移植、实体器官移植的患者，疑似存在侵袭性肺曲霉病（IPA）时，建议应用BALF、血液或血清曲霉PCR检测作为评估的一部分（强推荐，高级质量证据）。

核磁共振T2能够对常见致病念珠菌进行检测，包括白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌等。在高危人群中T2MR的阳性预测值和阴性预测值会更好。

mNGS作为传统方法的补充，能够提高诊断的敏感度和特异度。但该方法也存在一定的缺点，例如标本的选择和送检，真菌的破壁，以及mNGS报告的准确解读等，判断病原体究竟是定植、污染还是致病，需要结合患者的临床情况进行综合分析。

表3 不同系统真菌感染实验室诊断方法及其应用推荐

参考文献

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作者简介

夏欢

吉林大学第一医院呼吸与危重症医学科主治医师医学博士 PCCM专科医师
以第一作者发表SCI论文多篇
负责纵向及横向课题各1项，参与国家自然科学基金1项
中国老年医学学会呼吸病学分会青年学术委员
中国医药教育协会疑难肿瘤专业委员会委员
吉林省呼吸介入诊治联盟委员

本文根据“呼吸危重症菁英秀”视频整理，感谢夏欢医师予以审核。

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