文献学习46｜mNGS在肺部感染应用中的进展及思考（二）

孙婷中日友好医院发布于2021-09-23 浏览 3175 收藏

导语：mNGS是近年来新兴的病原学检测方法。其可对标本中所有微生物进行测序，并通过一系列的生物信息分析识别出病原体。与传统检测方法不同，mNGS具有快速鉴定、全面覆盖、灵敏度高等特点，在多种感染性疾病中均可应用。

问题、规范与研究方向

目前临床mNGS检测还是以外送商业实验室为主，因此对实验室的技术、设备、流程、数据平台方方面面都有可能存在差异，导致检出结果的差异。

cfDNA (cell-free DNA)：循环中的cfDNA分子来源于濒死的人类细胞和定植或侵入的微生物，在分解时将核酸释放到血液中。

血标本进行NGS检测，实际是对cfDNA进行检测的过程；人类细胞占绝对优势，肺炎患者的感染性病原微生物真正侵入或死亡分解到血中的含量是很微少的（理论上是有，但具体机制及多少没有证据支持）。

一项研究是最早针对血浆cfDNA诊断价值的研究，他们实验室也提出了自己的技术流程。在350例脓毒症患者，cfDNA结果与血液培养一致性达93.7%。

美国斯坦福大学医学院的K-T法cfDNA检测

科罗拉多及斯坦斯大学感染科：前瞻性研究纳入55例发热性中性粒细胞减少症（FN）患者。受试者的血标本分为发热后24 h内（T1）及之后每隔2、3 d的血样。将KT结果与血液培养（BC）和标准微生物检测（SMT）结果进行比较。在发热开始时（T1），10例患者（18%）BC阳性，41例患者（75%）KT阳性；有9例在T1时观察到一致的KT和BC结果。

华盛顿大学和斯坦福大学医学院一项研究，回顾性评价了114例造血干细胞移植（HCT）后疑似侵袭性霉菌感染（invasive mold infections，IMI）肺炎患者血浆mcfDNA-NGS的诊断能力。这些患者在HCT后14 d内采集血浆；并按临床诊断为确诊/可能的曲霉菌IMI感染（n=51）、确诊/可能的非曲霉菌IMI（n=24）、仅为疑似IMI（n=20）和非IMI对照（n=19）。cfDNA检测敏感性为51%；对非曲霉菌IMI的敏感性能到79%。

Clinical Infectious Diseases, 2020, ciaa1639

一项研究在24/25例患者中检测到病毒核苷酸序列。在25例患者中有16例检测到≥-3不同的病毒序列；Anelloviridae（24/25）和Pegivirus-1（9/25）是最常见的两种病毒。利用NGS能发现很多之前并不知道血液内病毒，但这些结果的临床意义并不肯定。

一项研究探讨血浆cfDNA能否预测血流感染。回顾BSI发作前7 d及之后4 d内收集的标本，进行NGS检测。12例癌症复发合并血流感染的儿童，共发生了19次BSI，有16次发作的预测样本可用。

JAMA Oncol, 2020, 6(4):552-556.

19次血流感染发作中，有3次没有前期血标本；剩余16例发作中，12例cfDNA检测前期预测到血流感染，敏感性75%。单看细菌感染的敏感性达80%。

敏感性及病原微生物浓度，与临近血流感染发作时间相关。

送检标本选择

用mNGS同时检测重症肺炎患者血样和支气管肺泡灌洗液（BALF）病原的临床意义和必要性尚不清楚。本研究旨在阐明重症肺炎患者应用mNGS同时对血液标本和BALF标本进行病原检测的临床意义和必要性。20例重症肺炎患者同时送检血和BALF；在17例BALF NGS阳性的患者中有10例血标本中也发现了病原菌；仅1例合并血流感染的患者可以通过常规细菌培养发现。BALF中的病原菌与血液标本中的病原菌高度一致。

Chen, et al. J Med Microbiol. 2020

另一项研究得出相反结论。前述提到的解放军总医院的研究亚组分析：37例有匹配采集的BAFL及血标本的CAP患者，同一病原微生物在BALF检出率明显高，但在均为阳性的病例中，两类标本检出的病原微生物类别一致性差。

BMC Infectious Diseases, 2021, 21:352

湘雅二医院研究：39例同时送检血标本及BALF标本NGS检测的肺炎患者；细菌培养证实：16例血培养阳性，13例血培养阴性；BALF阳性率明显高于血标本。

Can J Infect Dis Med Microbiol, 2020, 2020:6839103.

NGS检测的耐药基因与临床药敏比较

2019年，法国雷恩大学医学院，针对3525菌株（2751株大肠杆菌），介绍了NGS耐药基因检测的适用性，为临床提供更多选择可能。

Open Forum Infect Dis, 2019, 6(S1):S69-S78.

NGS检测应用于院感防控及多重耐药菌溯源

两篇2021年的综述

Cell Mol Life Sci, 2021, 78(6):2585-2606.

技术进展

适宜的去人源技术/富集技术
探索破壁技术最优的条件
可扩展探针捕获技术

宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识

原始报告的解读

按病种区别对待：

真菌/分枝杆菌类SMRN>1；病毒SMRN>3；细菌类结合优势病种排行前五位并SMRN>5（结合近3年文献）。
与各家实验室技术密切相关，最常用的事丰度及序列数。
倾向于阈值放宽，由临床医师严格把控最终判读结果。

除了临床诊断及应用价值外，mNGS作为一种技术/方法在肺部感染领域被关注比较多的研究方向。

我国的研究：32例细菌性脑膜炎儿童、30例未确诊的感染性儿童和10名匹配的健康个体，进行mNGS及生物信息分析。研究结果表明，与未确诊和健康儿童相比，细菌性脑膜炎儿童的脑脊液和血液中表现出不同的微生物群特征，根据这些特征，患者可分为不同的亚群，并与血液中CRP水平和脑脊液中粒细胞百分比相关。

Liao H, 2021. doi.org/10.1128/mSystems.00049-21.

应优先验证一个一致认可的和可靠的呼吸微生物组学研究方法，并进行纵向研究。对呼吸道菌群的深入了解对ARDS及VAP的防治具有重要的指导意义。

2019年，加州大学儿童医院：在免疫功能低下的儿童肺部检测到的微生物排列。红点代表潜在致病微生物。深蓝点代表所有其他潜在的致病微生物；浅蓝色圆点代表典型的非病原微生物。(A) 所有细菌、(B) 真菌、(C) RNA 病毒和 (D) DNA 病毒。免疫功能低下儿童的下呼吸道可能定值有多种细菌、真菌和病毒；可根据绝对和相对丰度来识别潜在的病原体；需要进行持续调查以确定免疫功能低下的肺部疾病儿童肺部异常微生物的致病意义。箭头指示博卡病毒和肺孢子菌的空心红点用于指示在该队列中仅观察到一次的生物体。

复旦大学附属儿童医院：难治性肺炎支原体肺炎患儿下呼吸道微生物群的特征是高度同质的微生物群落（以肺炎支原体为主），而不是对大环内酯类抗生素的耐药性增加。

与RMPP组相比，NRMPP组的抗生素耐药基因（ARG）更丰富，毒力因子基因（VFGs）分布更高。

Transl Pediatr, 2021, 10(3):604-615.

比较健康和疾病受试者微生物组学，才能更好地确定微生物多样性和构成。肺外微生物群的失调和分析，有助于理解肺部细菌清除的复杂作用和广谱抗生素对微生物群的非靶点效应。随着分子技术的进步，不仅在微生物诊断及肺部微生物组，更能研究宿主-病原体相互作用的机制。

分子病理研究：宿主免疫状态

一项研究纳入了8例新冠患者，146例社区获得性肺炎患者和20例健康对照。分析其BALF的宏转录组宿主免疫特征。

Cell Host Microbe, 2020 Jun 10.

肺泡灌洗液mNGS RNA流程数据用于宿主转录组分析-差异基因

mNGS用于新冠患者宿主转录组分析研究

新冠转录组研究拓展mNGS应用新方向。

研究纳入187例肺炎患者，基于临床及分子诊断结果，将其区分为新冠肺炎组及非新冠肺炎组，采集鼻咽拭子和痰液两种样本类型。
从病原体、微生物多样性及宿主响应3个纬度进行分析，寻找宿主免疫反应标志物以建立更好地辅助新冠肺炎感染诊断的方法。
通过转录组分析，研究者发现36个差异表达基因，这些基因不仅可作为预测分类器区分新冠患者与非新冠患者，还可预测新冠感染肺炎严重程度。

入组分类
入组187例肺炎患者，分为训练集与验证集：训练集入组38例新冠患者，75例非新冠患者；验证集入组24例新冠患者，50例非新冠患者；各组别均入组肺泡灌洗液（SP）和鼻咽拭子（NP）两种样本类型；测序平台与策略：illumina Nextseq550, SE75；测序数据量：＞10M reads/样本；